... jours perdus, ou presque ! Vive le DEB ! :s
Jour -1, lundi :
Rien de spécial. On ensemmence les fibroblastes et Morgane prend les mesures d'oxygraphie sur nos extraits bruts de levures si durement obtenus...
Jour 0, mardi, début des espoirs si vite déchus :
On applique le prétraitement thermique aux fibroblastes sur lesquels on fera le "vrai" traitement le lendemain avant de détecter la production de ROS par spectrofluorimétrie. Puis on s'essaie au spectrofluorimètre avec quelques cellules qui nous restaient de la veille. Marquage fluorimétrique avec le DCF (petit nom de la barbare 2',7'-dichlorofluorescein diactetate) qui est une sonde oxydée, in vivo, par les ROS (espèces réactives de l'oxygène). On tente de se familiariser avec le spectro, avec l'aide de Véronique R.. On parvient à un signal nickel, 40% de fluorescence sur des cellules stressées. On détecte bien les ROS. ;D
Jour 1, mercredi, début des hostilités :
C'est le jour J. On fait nos manipes de spectrofluorimétrie. Et là, c'est le drame ! Aucun signal, même pour les cellules dans les mêmes conditions que la veille. Mystère et boule de gomme ! C'est un monde qui s'effondre.
On souffle. On se passe les nerfs. On reprendra cela vendredi, plus "séquentiellement". On séparera très largement les manipes pour éviter de perdre de la fluorescence en cours de route...
Entre temps, on fait le prétaitement thermique pour les cultures dont on extraira les protéines le lendemain pour faire le western blot.
Jour 2, jeudi, étudiante recherche activement un précipice :
La journée commence normalement (quoi que ce mot n'ait plus guère de sens au bout de 3 semaines de franche galère), mais cela s'est arrêté là. On fait le choc thermique sur les cultures de fibroblastes. On extrait les protéines. Tout va bien pour l'instant. On se prépare à lancer le dosage microBCA pour quantifier les protéines obtenues. Avant, on doit récupérer du TCA pour concentrer la catalase purifiée lors des manipes de biochimie. On va voir un enseignant, il est midi. On n'a pas le temps de poser notre question qu'un "pas maintenant, je vais manger !" dans la limite de l'agressivité et sans un regard nous transperce ! Voilà comment perdre pratiquement 3h puisqu'on n'a pas pu avoir le TCA avant pratiquement 15h ! Bilan, on voulais, d'ici la fin de la journée faire un gel de protéines après concentration (3h au total), puis un transfert sur membrane pour l'immunorévélation, afin de laisser l'anticorps primaire incuber toute la nuit sur la membrane. Malheureusement, par la disponibilité des enseignants du jour, nous devons repousser le gel et le début du western à demain (vendredi). L'anticorps primaire devra incuber tout le week-end, et pour le coup, nous n'avons plus droit à la moindre once d'erreur... :s
La fin du DEB s'annonce donc avec un goût amer...
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